FERMENTASI ETANOL OLEH MIKROBA ANAEROB Saccharomyces cerevisiae

TUGAS MATA KULIAH BIOTEKNOLOGI FARMASI

NAMA : METTI RIA YULISTINA

NPM : A. 082. 0068

FERMENTASI ETANOL OLEH MIKROBA ANAEROB Saccharomyces cerevisiae

PENDAHULUAN

Fermentasi adalah proses produksi energi dalam sel dalam keadaan anaerobic (tanpa oksigen). Secara umum, fermentasi adalah salah satu bentuk respirasi anaerobik, akan tetapi, terdapat definisi yang lebih jelas yang mendefinisikan fermentasi sebagai respirasi dalam lingkungan anaerobik dengan tanpa akseptor elektron eksternal.

Anaerobik adalah kata teknis yang secara harfiah berarti "tanpa udara" (dimana "udara" biasanya berarti oksigen). Anaerob obligat akan mati bila terdapat oksigen karena tidak adanya enzim superoksida dismutase dan katalase yang dapat mengubah superoksida berbahaya yang timbul dalam selnya karena adanya oksigen.

Organisme anaerobik fakultatif adalah organisme, biasanya bakteri, yang menghasilkan ATP secara respirasi aerobik jika terdapat oksigen tetapi juga mampu melakukan fermentasi. Beberapa contoh bakteri anaerobik fakultatif adalah Staphylococci (Gram positif),Corynebac terium (Gram positif), dan Listeria (Gram positif). Organisme dalam KerajaanFungi (jamur) dapat juga tergolong anaerobik fakultatif, contohnya ragi. Faktor-faktor yang mempengaruhi perpindahan metabolisme dalam anaerobic fakultatif adalah konsentrasi oksigen dan materi fermentasi di lingkungan.

Gula adalah bahan yang umum dalam fermentasi. Beberapa contoh hasil fermentasi adalah etanol, asam laktat, dan hidrogen. Akan tetapi beberapa komponen lain dapat juga dihasilkan dari fermentasi seperti asam butirat dan aseton. Ragi dikenal sebagai bahan yang umum digunakan dalam fermentasi untuk menghasilkan etanol dalam bir, anggur dan minuman beralkohol lainnya. Respirasi anaerobik dalam otot mamalia selama kerja yang keras (yang tidak memiliki akseptor elektron eksternal), dapat dikategorikan sebagai bentuk fermentasi.

ETANOL

Etanol, disebut juga etil alkohol, alkohol murni, alkohol absolut, atau alkohol saja, adalah sejenis cairan yang mudah menguap, mudah terbakar, tak berwarna, dan merupakan alkohol yang paling sering digunakan dalam kehidupan sehari-hari. Senyawa ini merupakan obat psikoaktif dan dapat ditemukan pada minuman beralkohol dan termometer modern. Etanol termasuk ke dalam alkohol rantai tunggal, dengan rumus kimia C₂H₅OH dan rumus empiris C₂H₆O. Ia merupakan isomer konstitusional dari dimetil eter. Etanol sering disingkat menjadi EtOH, dengan "Et" merupakan singkatan dari gugus etil (C₂H₅).

Sifat Medis Etanol

Etanol telah banyak dibukti menyebabkan kelainan pada metabolisme lipoprotein, sintesis kolesterol dan penurunan sintesis asam empedu, asam kolat, fosfolipid, serta penurunan aktivitas enzim 12 alpha-hydroxylase.

Penggunaan Etanol

Etanol banyak digunakan sebagai pelarut berbagai bahan-bahan kimia yang ditujukan untuk konsumsi dan kegunaan manusia. Contohnya adalah pada parfum, perasa, pewarna makanan, dan obat-obatan. Dalam kimia, etanol adalah pelarut yang penting sekaligus sebagai stok umpan untuk sintesis senyawa kimia lainnya. Dalam sejarahnya etanol telah lama digunakan sebagai bahan bakar.

FERMENTASI ETANOL

Etanol untuk kegunaan konsumsi manusia (seperti minuman beralkohol) dan kegunaan bahan bakar diproduksi dengan cara fermentasi. Spesies ragi tertentu (misalnya Saccharomyces cerevisiae) mencerna gula dan menghasilkan etanol dan karbon dioksida:

C₆H₁₂O₆ → 2 CH₃CH₂OH + 2 CO₂.

Konsentrasi etanol yang tinggi akan beracun bagi ragi. Pada jenis ragi yang paling toleran terhadap etanol, ragi tersebut hanya dapat bertahan pada lingkungan 15% etanol berdasarkan volume.

Untuk menghasilkan etanol dari bahan-bahan pati, misalnya serealia, pati tersebut haruslah diubah terlebih dahulu menjadi gula. Dalam pembuatan bir, ini dapat dilakukan dengan merendam biji gandum dalam air dan membiarkannya berkecambah. Biji gandum yang beru berkecambah tersebut akan menghasilkan enzim amilase. Biji kecambah gandum ditumbuk, dan amilase yang ada akan mengubah pati menjadi gula.

Untuk etanol bahan bakar, hidrolisis pati menjadi glukosa dapat dilakukan dengan lebih cepat menggunakan asam sulfat encer, menambahkan fungi penghasil amilase, atapun kombinasi dua cara tersebut.

Reaksi dalam fermentasi berbeda-beda tergantung pada jenis gula yang digunakan dan produk yang dihasilkan. Secara singkat, glukosa (C6H12O6) yang merupakan gula paling sederhana , melalui fermentasi akan menghasilkan etanol (2C2H5OH). Reaksi fermentasi ini dilakukan oleh ragi, dan digunakan pada produksi makanan.

Persamaan Reaksi Kimia

C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2 + 2 ATP (Energi yang dilepaskan:118 kJ per mol)

Dijabarkan sebagai:

Gula (glukosa, fruktosa, atau sukrosa) → Alkohol (etanol) + Karbon dioksida + Energi (ATP)

Pada beberapa mikroba peristiwa pembebasan energi terlaksana karena asam piruvat diubah menjadi asam asetat + CO2 selanjutaya asam asetat diabah menjadi alkohol.

Dalam fermentasi alkohol, satu molekul glukosa hanya dapat menghasilkan 2 molekul ATP, bandingkan dengan respirasi aerob, satu molekul glukosa mampu menghasilkan 38 molekul ATP.
Reaksinya :

1. Gula (C6H12O6) ————> asam piruvat (glikolisis)

2. Dekarbeksilasi asam piruvat.

Asampiruvat ————————————————————> asetaldehid + CO2.

piruvat dekarboksilase (CH3CHO)

3. Asetaldehid oleh alkohol dihidrogenase diubah menjadi alcohol (etanol).

2 CH3CHO + 2 NADH2 —————————————————> 2 C2HsOH + 2 NAD.

alkohol dehidrogenase

enzim

Ringkasan reaksi :

C6H12O6 —————> 2 C2H5OH + 2 CO2 + 2 NADH2 + Energi

Untuk menghasilkan tiap-tiap produk fermentasi di atas dibutuhkan kondisi fermentasi yang berbeda-beda dan jenis mikroba yang bervariasi juga karakteristiknya. Oleh karena itu, diperlukan keadaan lingkungan, substrat (media), serta perlakuan (treatment) yang sesuai sehingga produk yang dihasilkan optimal.

Pada percobaan ini digunakan ragi Saccharomycess cereviceae, yang bersifat fakulktatif anaerobik. Pada kondisi aerobik sebagai akseptor elektron terakhir pada jalur reaksi bioenergetik adalah oksigen. Pemanfaatan pada keadaan ini menghasilkan penambahan biomassa sel dengan persamaan reaksi sebagai berikut:

C6H12O6 . CO2 + H2O + biomassa sel

Pada kondisi anaerobik, Saccharomycess cereviceae menggunakan senyawa organik sebagai akseptor elektron terakhir pada jalur reaksi bioenergetik. Dalam hal ini yang digunakan adalah glukosa dari substrat dengan hasil akhir perombakan berupa alkohol (etanol), aldehid, asam organik, dan fussel oil. Reaksi yang berlangsung dalam keadaan anaerobik tersebut adalah sebagai berikut:

C6H12O6 . 2 C2H5OH + 2 CO2 + produk samping

Pada percobaan ini digunakan glukosa sebagai substrat utama. Hal ini disebabakan struktur model glikosa yang sederhana sehingga mudah digunakan oleh Saccharomycess cereviceae. Glukosa digunakan sebagai sumber energi dan sumber karbon yang digunakan untuk membentuk material penyusun sel baru. Glukosa disebut juga reducing sugar sehingga pemanfaatannya oleh Saccharomycess cereviceae dilakukan dengan mengoksidasi glukosa yaitu dengan cara pemutusan ikatan rangkap pada gugus karbonil glukosa. Media yang digunakan di dalam fermentasi harus memenuhi syarat-syarat sebagai berikut:

1. mengandung nutrisi yang dibutuhkan bagi pertumbuhan sel Saccharomycess cereviceae

2. mengandung nutrisi yang dapat digunakan sebagai sumber energi bagi sel Saccharomycess cereviceae

3. tidak mengandung zat yang menghambat pertumbuhan sel

4. tidak terdapat kontaminan yang dapat meningkatkan persaingan dalam penggunaan substrat.

Oleh karena itu, selain glukosa, ke dalam medium fermentasi juga ditambahkan zat-zat lain yang berfungsi sebagai sumber makronutrien dan mikronutrien serta growth factor. Dalam percobaan ini, proses fermentasi ragi tersebut melalui 4 tahapan:

1. tahap persiapan medium fermentor

2. tahap sterilisasi

3. tahap pembuatan inokulum dan pengembangan starter

4. tahap pelaksanaan fermentasi

·        Tahap Persiapan Medium Fermentasi

Medium yang digunakan adalah medium cair yang terdiri dari 2 macam larutan. Larutan pertama berisi garam-garam nutrisi untuk pertumbuhan ragi, sedangkan larutan kedua adalah substrat yang umumnya berupa latutan glukosa dalam air. Nutrisi yang diperlukan dalam medium petumbuhan ragi antara lain unsur N, S, O, H, Mg, K, Ca. Glukosa berfungsi sebagai sumber karbon dan sumber energi. Kadar senyawa-senyawa yang diperlukan supaya medium dapat mendukung pertumbuhan ragi secara optimal harus ditentukan berdasarkan komposisi masing-masing unsur dalam sel ragi yang telah banyak diteliti dan dibukukan.

Adapun komponen dari media yang digunakan adalah sebagai berikut:

a. Substrat utama

Sebagai substrat utama digunakan larutan glukosa. Karena glukosa adalah substrat utama, maka pertumbuhan biomassa sel Saccharomycess cereviceae merupakan fungsi dari konsentrasi glukosa. Hasil perombakan glukosa oleh sel adalah berupa CO2 dan H2O.

b. Sumber makronutrien, mikronutrien, dan growth factor. Menggunakan zat-zat sebagai berikut:

1. (NH4)2SO4 sebagai sumber nitrogen yang berguna bagi pembentukan asam nukleat dan asam-asam amino.

2. K2SO4 sebagai sumber K+ yang merupakan kofaktor enzim

3. Na2HPO4.2H2O sebagai sumber Na dan P. Na berfungsi sebagai kofaktor dan P berguna untuk sintesis asam nukleat, ATP, fosfolipid, dan senyawa yang mengandung fosfor lainnya.

4. MgSO4 sebagi sumber Mg yang berperan di dalam stabilisasi ribosom, stabilisasi membran dan dinding sel, serta berfungsi sebagai kofaktor enzim.

5. CaCl2 sebagai sumber Ca untuk stabilisasi dinding sel.

6. ZnSO4 sebagai sumber Zn yang berfungsi sebagai regulator enzim

7. Fe(NH4)(SO4) sebagai sumber Fe, makronutrien pembentuk sitokrom pembawa elektron dalam jalur transportasi elektron.

8. CuSO4 sebagai sumber Cu yang berperan penting dalam reaksi redoksmetabolisme.

9. yeast extract sebagai penyedia asam-asam amino tunggal, growth factor dan berbagai vitamin yang dibutuhkan sel

10. aqua , sebagai media pelarut dan pengaduk dalam transportasi senyawa.

Setelah medium substrat dan medium nutrisi dicampurkan, diusahakan Ph tetap 4-5 yang merupakan pH optimal pertumbuhan sel ragi.

·        Tahap Sterilisasi

Sterilisasi dilakukan terhadap bahan dan alat sehingga terbebas dari kontaminasi mikroorganisme lain. Sterilisasi perlu dilakukan karena kontaminasi mikroba lain akan memberikan dampak yang tidak menguntungkan sebagai berikut:

1. kontaminan meningkatkan persaingan di dalam mengkonsumsi substrat sehingga akan mengurangi perolehan

2. kontaminan dapat menghambat proses metabolisme sel sehingga akan mengurangi perolehan

3. kontaminan meningkatkan turbiditas sehingga dapat mengacaukan pengukuran terhadap jumlah sel setiap saat.

Pada percobaan ini proses sterilisasi dilakukan di laboratorium dengan menggunakan autoclave. Autoclave melakukan sterilisasi dengan menggunakan panas lembab. Keuntungan penggunaan panas lembab dalam proses sterilisasi adalah kelembaban mempermudah proses denaturasi protein sel kontaminan. Autoclave dioperasikan pada tekanan 15 psia dan temperatur 121 oC selama 15 menit. Pada saat sterilisasi beberapa lubang pada fermentor ditutup dengan kapas. Tujuannya adalah untuk mengalirkan udara panas dari dalam fermentor sehingga tidak terjadi tekanan yang terlalu tinggi di dalam fermentor selama sterilisasi. Sedangkan tujuan lain penggunaan kapas adalah agar kehilangan uap air selama sterilisasi minimal. Hal yang perlu ditekankan pada sterilisasi medium ini adalah larutan nutrisi tidak boleh disterilisasi bersamaan dengan larutan glukosa agar tidak terjadi proses karamelisasi. Karamelisasi disebut juga proses reduksi Maillard. Proses ini terjadi karena gugus karbonil pada glukosa bereaksi dengan gugus amonium atau protein dari medium sehingga membentuk nitrogen hitam. Senyawa ini tidak dapat dioksidasi mikroba dan disebut unfermented substrate. Akibat reaksi ini glukosa tidak dapat diuraikan oleh sel ragi, bahkan menjadi inhibitor terhadap sel ragi tersebut.

Reaksi karamelisasi glukosa ini berlangsung sebagai berikut:

R-COH + NH2-R’ . R-COH-NH2 + produk lain

Karena itu, proses sterilisasi dilakukan terpisah. Larutan nutrisi dimasukkan dalam fermentor dan disterilisasi sekaligus bersama fermentornya. Larutan glukosa disterilisasi sendiri dalam erlenmeyer. Setelah fermentor dan medium steril dingin, larutan glukosa steril dimasukkan secara aseptik ke dalam fermentor. Kemudian pH diatur sampai 4,5 dengan menambahkan HCH steril 1 N. Nilai 4,5 adalah pH optimum pertumbuhan ragi.

      Tahap Penyiapan Inokulum

Setelah seluruh alat dan bahan steril, dilakukan inokulasi Saccharomycess cereviceae dari biakan murni. Yang digunakan sebagai inokulum adalah biakan ragi pada agar miring. Komposisi medium starter adalah sama dengan komposisi media fermentasi dengan penambahan growth factor. Inokulum tersebut dimasukkan dalam campuran larutan nutrisi dan substrat yang diambil sebagian dari fermentor dan dimasukkan dalam labu erlenmeyer 150 mL. Tujuan dibiakkannya ragi dalam starter adalah mengadaptasikan sel terhadap media fermentasi. Dengan adanya adaptasi pada starter ini diharapkan lag phase sebagai tahap awal fermentasi dilewati. Biakan diusahakan tepat berada pada akhir fasa logaritmik. Dengan demikian pertumbuhan sel ragi akan maksimum dalam waktu yang relatif singkat. InokulasiSacchromycess cereviceae dilakukan secara aseptis untuk menjaga kemurnian biakan. Setelah dimasukkan dalam medium, inokulum tersebut diletakkan dalam alat shaker selama, paling cepat, 16 jam. Fungsi shaker adalah mempermudah difusi oksigen ke dalam medium sehingga kontak antara dan inokulum makin banyak dan homogen. Hal ini penting dilakukan untuk menjaga kondisi biakan tetap aerobik. Jika difusi oksigen dalam medium lancar, kadar DO (oksigen terlarut) dalam medium akan cukup mendukung pertumbuhan sel secara aerobik. Jika sel hidup secara aerobik, biomassa baru akan lebih banyak terbentuk daripada etanol. Dengan demikian pada akhir masa inkubasi shaker ini diharapkan juga sel sudah berada pada akhir fasa logaritmik.

·        Tahap Pelaksanaan Fermentasi

Tahap ini dimulai saat inokulum yang telah beradaptasi dalam medium dimasukkan dalam medium di fermentor. Pada praktikum ini fermentor yang dipakai bervolume 5 liter. Fermentor adalah suatu reaktor yang dipersiapkan untuk melakukan reaksi fermentasi yang dilengkapi dengan pengaduk, saluran aerasi, dan perlengkapan lainnya. Pelaksanaan fermentasi dilakukan dengan cara sebagai berikut:

1. Nutrisi, substrat, dan inokulan dimasukkan ke dalam fermentor yang dilakukan secara aseptis. Nutrisi dimasukkan ke dalam fermentor sebelum disterilisasi dalam autoclave. Substrat dan inokulan dimasukkan dengan cara memanaskan mulut inlet dengan kapas yang dibakar kemudian medium dan inokulum dimasukkan ke dalam fermentor.

2. Kemudian dilakukan kecepatan aerasi dan agitasi. Aerasi berfungsi sebagai penyuplai oksigen untuk sel ragi dalam bentuk gelembung gas. Aerasi diatur pada kecepatan skala 9. Laju oksigen yang disuplai ke dalam fermentor dijaga stabil. Fluktuasi laju alir oksigen ini dapat menurunkan unjuk kerja fermentor karena laju transfer O2 tidak tetap sehingga metabolisme sel ragi terganggu karena kadar DO yang tidak stabil. Agitasi berfungsi sebagai alat penghomogen larutan fermentasi. Agitasi dilakukan pada kecepatan 600 rpm. Pengadukan dilakukan oleh impeller yang berjumlah 3 buah. Semakin banyak impeller di dalam fermentor semakin homogen larutan tersebut. Laju alir udara dan pengadukan saling terkait satu sama lain. Pengaliran udara berfungsi untuk menjaga suplai oksigen agar tetap sedangkan pengadukan akan meningkatkan laju dispersi oksigen ke dalam larutan dan meratakan kadar oksigen di seluruh medium fermentasi. Di pinggiran fermentor juga terdapat baffle yang berfungsi mencegah terjadinya vortex (pusaran air) sehingga dapat meningkatkan efisiensi aerator. Pengaturan udara keluar dan masuk fermentor dilakukan sedemikian rupa sehingga kontaminasi dapat diminimalkan, yaitu dengan cara menggunakan filter mikroba kapas pada aliran masuk dan menggunakan larutan CuSO4 yang bersifat oligodinamik dan mampu membunuh mikroba kontaminan.Pencampuran inokulum ke dalam medium fermentor dilakukan secara aseptik dengan menyalakan api di sekitar tempat pemasukan inokulum. Sebaiknya, sebelum proses fermentasi dimulai, ke dalam medium fermentor ditambahkan zat antifoam yang berfungsi mencegah terjadinya foaming. Zat antifoam yang banyak digunakan di industri adalah silicon. Foaming terjadi karena protein terdenaturasi dalam medium fermentasi. Selain menggunakan zat kimia, foaming juga dapat dicegah secara mekanik dengan mengatur putaran agitator. Hal ini lebih sering dilakukan karena zat kimia yang terlalu banyak ditambahkan ke dalam medium dapat menjadi inhibitor bagi pertumbuhan mikroba. Pada awal fermentasi diusakan pH medium adalah 4,5 yang optimal bagi pertumbuhan ragi. Selama fermentasi pH medium sangat mungkin mengalami penurunan karena terbentuknya asam organik sebagai produk samping fermentasi. Karena itu pH medium harus dipantau, jangan sampai terlalu drop yang akan mengakibatkan sel ragi mati.

Referensi :

·         Anonymous. 2007. Fermentasi. http://www.google.co.id.

·         Myers, Richard L.; Myers, Rusty L. (2007). The 100 most important chemical compounds: a reference guide. Westport, Conn.: Greenwood Press. hlm. 122. ISBN 0313337586.

·         Couper, A.S. (1858). "On a new chemical theory." Philosophical magazine 16, 104–116. Online reprint

·         Hennell, H. (1828). "On the mutual action of sulfuric acid and alcohol, and on the nature of the process by which ether is formed". Philosophical Transactions 118 (365–71): 365. doi:10.1098/rstl.1828.0021.

·         CRC Handbook of Chemistry, 44th ed.

·         Encyclopedia of chemical technology". 9. (1991). 813.

·         Costigan MJ, Hodges LJ, Marsh KN, Stokes RH, Tuxford CW (1980). "The Isothermal Displacement Calorimeter: Design Modifications for Measuring Exothermic Enthalpies of Mixing". Aust J Chem. 33 (10): 2103–19. doi:10.1071/CH9802103. http://www.publish.csiro.au/nid/51/paper/CH9802103.htm.

·         Mills, G.A.; Ecklund, E.E. "Mills GA, Ecklund EE (1987). "Alcohols as Components of Transportation Fuels". Annual Review of Energy 12: 47–80. doi:10.1146/annurev.eg.12.110187.000403. http://arjournals.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.eg.12.110187.000403?journalCode=energy.

·         Roberts, John D.; Caserio, Marjorie C. (1977). Basic Principles of Organic Chemistry. W. A. Benjamin, Inc. ISBN 0-8053-8329-8.

·         Morais PB, Rosa CA, Linardi VR, Carazza F, Nonato EA (November 1996). "Production of fuel alcohol by Saccharomyces strains from tropical habitats". Biotechnology Letters 18 (11): 1351–6. doi:10.1007/BF00129969. http://www.springerlink.com/content/h32k825756g41318/.

·         Badger, P.C. "Ethanol From Cellulose: A General Review." p. 17–21. In: J. Janick and A. Whipkey (eds.), Trends in new crops and new uses. ASHS Press, 2002, Alexandria, VA. Retrieved on September 2, 2007.

Read more >>